Báo cáo khóa học: Active site residues and mechanism of UDP-glucose dehydrogenase

Active Site Residues and Mechanism of UDP-Glucose Dehydrogenase

Tên đề tài: Active Site Residues and Mechanism of UDP-Glucose Dehydrogenase

Tác giả: Xue Ge, Lisa C. Penney, Ivo van de Rijn, and Martin E. Tanner

Lĩnh vực: Hóa sinh, Khoa học phân tử

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này tập trung vào việc làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của enzyme UDP-glucose dehydrogenase (UGDH) từ vi khuẩn Streptococcus pyogenes. UGDH là enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa kép UDP-glucose thành UDP-glucuronic acid, một quá trình quan trọng trong nhiều con đường sinh hóa. Nghiên cứu sử dụng các phương pháp như đột biến định hướng vị trí (site-directed mutagenesis), nghiên cứu động học đồng vị (kinetic isotope effect studies) và phân tích cấu trúc tinh thể X-quang để xác định vai trò của các amino acid tại vị trí hoạt động của enzyme. Đặc biệt, nghiên cứu làm rõ vai trò của cysteine tại vị trí 260 (Cys260) trong việc hình thành trung gian thioester cộng hóa trị và vai trò của các amino acid khác như Thr118, Lys204, Asn208, Glu141, Glu145, Asp264 trong các bước truyền hydride và thủy phân. Các thí nghiệm với enzyme đột biến Cys260Ala cho thấy enzyme này vẫn có khả năng oxy hóa trung gian aldehyde đã hydrat hóa nhưng không thể oxy hóa UDP-glucose một cách hiệu quả, gợi ý Cys260 đóng vai trò quan trọng trong cả hai bước oxy hóa. Nghiên cứu cũng chứng minh rằng quá trình xúc tác liên quan đến việc hình thành một trung gian aldehyde cộng hóa trị và quá trình này không tạo ra imine trung gian.

Mục lục chi tiết:

• Active site residues and mechanism of UDP-glucose dehydrogenase
• Correspondence to M. E. Tanner
• Abbreviations
• Enzyme
• Figure 1. The mechanism of the reaction catalyzed by UDP-glucose dehydrogenase.
• Experimental procedures
• General procedures
• Site-directed mutagenesis and mutant protein expression
• Figure 2. The proposed mechanism for the oxidation of the hydrated aldehyde intermediate by the Cys260Ala mutant.
• Solvent isotope incorporation study
• Figure 3. Two scenarios outlining the residues involved in catalyzing the hydride transfer steps.
• Kinetic isotope effect studies
• Figure 4. 13C NMR spectra of the carboxyl group of UDP-glucuronic acid (A) generated in 50% H218O/50% H₂O and (B) generated in 100% H₂O.
• Site-directed mutagenesis
• Studies on Cys260Ala
• Figure 5. Kinetic trace following the full time-course of the incubation of the aldehyde intermediate and NADH with either wild-type UDP-glucose dehydrogenase (solid line) or the Cys260Ala mutant (dashed line).
• Figure 6. The dismutation of the aldehyde intermediate during an incubation with NADH and wild-type UDP-glucose dehydrogenase.
• Table 1. Kinetic constants and kinetic isotope effects for the reactions catalyzed by the wild-type and mutant UDP-glucose dehydrogenases.
• Discussion
• Acknowledgements
• References