Báo cáo khoa học: Tissue expression and biochemical characterization of human 2-amino 3-carboxymuconate 6-semialdehyde decarboxylase, a key enzyme in tryptophan catabolism

Tissue Expression and Biochemical Characterization of Human 2-amino 3-carboxymuconate 6-semialdehyde Decarboxylase, a Key Enzyme in Tryptophan Catabolism

Tác giả: Lisa Pucci, Silvia Perozzi, Flavio Cimadamore, Giuseppe Orsomando and Nadia Raffaelli

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích biểu hiện mô và đặc điểm sinh hóa của enzyme decarboxylase 2-amino 3-carboxymuconate 6-semialdehyde (ACMSD) ở người. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa tryptophan, điều hòa sự tổng hợp NAD và ảnh hưởng đến sự hình thành quinolinate và picolinate. ACMSD được xác định là một mục tiêu điều trị tiềm năng cho các rối loạn liên quan đến sự gia tăng các chất chuyển hóa của tryptophan. Nghiên cứu đã khảo sát biểu hiện của hai dạng transcript ACMSD được ghép nối thay thế (ACMSD I và II) trong não, gan và thận người bằng phương pháp PCR thời gian thực. Kết quả cho thấy cả hai dạng transcript đều có mặt ở thận và gan, với biểu hiện cao nhất ở thận. ACMSD II không biểu hiện ở não, trong khi ACMSD I chỉ có mặt với lượng rất nhỏ. Các dạng cDNA đã được tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện nấm men, và chỉ ACMSD I thể hiện hoạt tính enzyme. Enzyme này, sau khi tinh sạch, được mô tả là một dạng đơn phân, với độ pH tối ưu rộng, hằng số Michaelis (Km) là 6.5 µM và hằng số xúc tác (kcat) là 1.0 s⁻¹. ACMSD I bị ức chế bởi axit quinolinic, axit picolinic và axit kynurenic, và được hoạt hóa nhẹ bởi Fe²⁺ và Co²⁺. Các thí nghiệm đột biến điểm đã xác nhận vai trò xúc tác của các gốc amino acid quan trọng. Tuy nhiên, các đặc tính của enzyme người có sự khác biệt đáng kể so với enzyme vi khuẩn, cho thấy rằng cofactor kim loại có thể được che giấu sâu bên trong protein.

Mục lục chi tiết:

• Tissue expression and biochemical characterization of human 2-amino 3-carboxymuconate 6-semialdehyde decarboxylase, a key enzyme in tryptophan catabolism
• Keywords
• Correspondence
• Abbreviations
• Figure 1. Schematic overview of tryptophan catabolism through the kynurenine pathway.
• Figure 2. Alternative splicing of human ACMSD gene.
• Table 1. Oligonucleotide primer sequences.
• Figure 3. ACMSDI and ACMSD II extracellular expression.
• Figure 4. Quantitation of ACMSD variants by real-time PCR.
• Quantitation of ACMSD variants in liver, kidney and brain
• ACMSD I purification and characterization
• Table 2. Purification of recombinant human ACMSD I.
• Figure 5. Purification of recombinant human ACMSD I.
• Figure 6. Effect of pH on ACMSD I activity.
• Figure 7. Lineweaver-Burk analysis of ACMSD I.
• Table 3. Influence of metal ions on human ACMSD I activity.
• Table 4. Influence of tryptophan catabolites on human ACMSD I activity.
• Figure 8. Alignment between human (Hs) and P. fluorescens (Psf) ACMSD.
• Figure 9. Hydrophobicity profiles of human (A) and P. fluorescens (B) ACMSD.
• Discussion
• Figure 10. Homology modeling of human ACMSD I.
• Experimental procedures
• PCR amplification and cloning of ACMSD isoforms
• Real-time PCR
• Expression of ACMSD isoforms in E. coli
• Expression of ACMSD isoforms in P. pastoris
• Site-directed mutagenesis
• ACMSD I purification
• Gel filtration chromatography
• Assay for ACMSD activity
• Three-dimensional structure prediction
• Acknowledgements
• References