Báo cáo khoa học: The absence of an identifiable single catalytic base residue in Thermobifida fusca exocellulase Cel6B

The Absence Of An Identifiable Single Catalytic Base Residue in Thermobifida Fusca Exocellulase Cel6B

Tác giả: Thu V. Vuong and David B. Wilson

Lĩnh vực: Molecular Biology and Genetics, Cornell University, Ithaca, NY, USA

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định các gốc axit và bazơ xúc tác trong enzyme exocellulase Cel6B từ Thermobifida fusca. Các thực nghiệm đột biến định hướng và động học đã được tiến hành để làm sáng tỏ cơ chế xúc tác của enzyme. Kết quả cho thấy Asp274 là gốc axit xúc tác, phù hợp với các enzyme thuộc họ hydrolase glycoside nhóm 6. Tuy nhiên, không xác định được một gốc bazơ xúc tác đơn lẻ. Thay vào đó, các nhà nghiên cứu đề xuất một cơ chế thủy phân mới liên quan đến mạng lưới truyền proton để thực hiện chức năng của bazơ xúc tác. Nghiên cứu cũng khám phá vai trò của các gốc axit amin khác trong hoạt động và liên kết với cơ chất của enzyme.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Introduction
• Abbreviations
• Catalytic residues of TfCel6B
• Results
• Cel6B structural model
• Selection of amino acids for mutation
• Asp274 mutation
• Asp226 mutation
• Asp497, Glu495, Ser232 and Tyr220 mutation
• The Y220A enzyme
• D226A/S232A double mutation
• Discussion
• Key residues
• Absence of a single catalytic base
• Proton-transferring network
• Cleavage of internal linkages
• Experimental procedures
• Strains and plasmids
• Site-directed mutagenesis and enzyme purification
• Polysaccharide assays
• 2,4-DNPC assay
• Azide rescue assay
• Substrate-binding assays
• CMC viscosity
• Fluorescence quenching titration
• TLC
• CD analysis
• Acknowledgements
• References