Báo cáo khoa học: Tet repressor residues indirectly recognizing anhydrotetracycline

Tet repressor residues indirectly recognizing anhydrotetracycline

Tác giả: Peter Schubert, Klaus Pfleiderer và Wolfgang Hillen
Lĩnh vực: Mikrobiologie, Biochemie und Genetik
Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm hiểu cơ chế nhận biết của Tet repressor (TetR) đối với tetracycline (tc) và anhydrotetracycline (atc). Hai biến thể trình tự TetR có sự tương đồng 63% axit amin đã được sử dụng để so sánh. Kết quả cho thấy cả hai biến thể đều được ổn định bởi tetracycline ở mức độ tương tự, nhưng anhydrotetracycline lại phân biệt rõ rệt giữa chúng. Thông qua việc xây dựng các protein lai TetR, các nhà nghiên cứu đã xác định được hai axit amin tại vị trí 57 và 61 là yếu tố quyết định sự ổn định của phức hợp. Động học liên kết cho thấy sự nhận biết khác nhau của anhydrotetracycline đối với các biến thể TetR này, mặc dù hằng số liên kết cho thấy sự ổn định tương tự. Các axit amin được xác định có liên quan đến một mạng lưới nước nội tại, gợi ý rằng sự khác biệt về nhiệt động lực học quan sát được có thể là do hiệu ứng entropy. Sự trao đổi các axit amin tương tác này giữa hai biến thể TetR ảnh hưởng đến tính linh hoạt của tổ chức nước này, nhấn mạnh tầm quan trọng của các phân tử nước cấu trúc bị chôn vùi đối với việc nhận biết phối tử và chức năng protein. Do đó, mô-đun cấu trúc này dường như là một yếu tố cần thiết cho tính mềm dẻo của protein TetR có nhiều vị trí liên kết phối tử.
Mục lục chi tiết:
– Tet repressor residues indirectly recognizing anhydrotetracycline
– Experimental procedures
– Material and general methods
– Bacterial strains and plasmids
– Construction of the chimeric tetR genes
– β-Galactosidase assay
– Purification of the TetR variants
– Fluorescence and CD spectroscopy
– Unfolding of the TetR complexes, thermodynamic and kinetic constants
– Results
– Fluorescence probes to determine complex stability
– Thermodynamic stabilities of TetR[tc-Mg]2 and TetR[atc-Mg]2 complexes
– Interaction of TetR(B/D) chimera with [atc-Mg]+
– Identifying single residues for atc recognition
– Association rate constants for inducer binding to the TetR(D/B) variants
– Association rate constant of TetR[atc-Mg]2 complex formation
– Discussion
– Acknowledgements
– References