Báo cáo Y học: Reconstitution of Fo of the sodium ion translocating ATP synthase of Propionigenium modestum from its heterologously expressed and purified subunits

Reconstitution of F_o of the sodium ion translocating ATP synthase of Propionigenium modestum from its heterologously expressed and purified subunits

Tác giả: Franziska Wehrle, Yvonne Appoldt, Georg Kaim and Peter Dimroth

Lĩnh vực: Vi sinh vật học, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả quá trình biểu hiện và tinh chế các tiểu đơn vị a và b của phức hợp F_o từ ATP synthase chuyển ion natri của vi khuẩn Propionigenium modestum trong Escherichia coli. Các tiểu đơn vị tái tổ hợp đã được tái hợp thành phức hợp F_o chức năng trong ống nghiệm và tích hợp vào liposome. Các liposome F_o này cho thấy khả năng vận chuyển ion natri, hoạt động này có thể bị ức chế bởi DCCD. Khi kết hợp với phức hợp F₁, phức hợp F₁F_o hoàn chỉnh đã được hình thành, có khả năng tổng hợp ATP, bơm natri phụ thuộc ATP và thủy phân ATP.

Mục lục chi tiết:

• Cloning of atpB and atpF from P. modestum ATPase
• Heterologous expression of the genes encoding the P. modestum subunits a and b in E. coli
• Isolation of membranes and solubilization
• Purification of subunit a from E. coli C43(DE3)/pPmaHisN
• Purification of subunit b from E. coli C43(DE3)/pPmbHisC
• Purification of monomeric subunit c from PEF42(DE3)/pT7c and of C11 from P. modestum and I. tartaricus
• Preparation of liposomes containing F_o
• Reconstitution of the ATPase enzyme complex from reconstituted F_o liposomes and F₁
• Transport experiments
• Determination of ATPase activity
• Expression and purification of subunits a and b from P. modestum
• Reconstitution of functional F_o from its purified subunits
• ATP hydrolysis activities of reconstituted F_oF₁ liposomes
• Kinetics of ²²Na⁺ transport in reconstituted proteoliposomes.