Báo cáo khoa học: Production and characterization of a thermostable L-threonine dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus

Production and characterization of a thermostable L-threonine dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus

Tác giả: Ronnie Machielsen and John van der Oost

Lĩnh vực: Microbiology, Wageningen University, the Netherlands

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này mô tả việc sản xuất và đặc tính hóa enzyme L-threonine dehydrogenase (Pf-TDH) từ vi khuẩn cổ đại ưa nhiệt Pyrococcus furiosus. Enzyme này đã được biểu hiện thành công trong Escherichia coli và tinh sạch. Pf-TDH có cấu trúc tetrameric với khối lượng phân tử khoảng 155 kDa và cho thấy độ bền nhiệt cao, với hoạt động tăng lên đến 100 °C. Enzyme này đặc hiệu với NAD(H) và có hoạt tính tối đa với L-threonine và acetoin trong các phản ứng oxy hóa và khử. Pf-TDH cũng sử dụng L-serine và D-threonine làm cơ chất, nhưng không oxy hóa các L-amino acid khác. Hoạt động của enzyme yêu cầu các cation hóa trị hai như Zn2+ và Co2+, và chứa ít nhất một nguyên tử kẽm trên mỗi tiểu đơn vị. Các giá trị Km cho L-threonine và NAD+ ở 70 °C lần lượt là 1.5 mm và 0.055 mm. Nghiên cứu cũng thảo luận về vai trò sinh lý tiềm năng của Pf-TDH trong quá trình dị hóa L-threonine.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Abbreviations
• Results
• Analysis of nucleotide and amino-acid sequences
• Purification of recombinant Pf-TDH
• Substrate and cofactor specificity
• Metals and inhibitors
• Thermostability and pH optima
• Enzyme kinetics
• Discussion
• Experimental procedures
• Chemicals and plasmids
• Organisms and growth conditions
• Cloning and sequencing of the alcohol dehydrogenase encoding gene
• Production and purification of ADH
• Size-exclusion chromatography
• SDS/PAGE
• Activity assays
• pH optimum
• Optimum temperature and thermostability
• Kinetics
• Salts, metals and inhibitors
• Acknowledgements
• References