Production and characterization of a secreted, C-terminally processed tyrosinase from the filamentous fungus Trichoderma reesei

Tác giả: Emilia Selinheimo, Markku Saloheimo, Elina Ahola, Ann Westerholm-Parvinen, Nisse Kalkkinen, Johanna Buchert, and Kristiina Kruus

Lĩnh vực: Khoa học nông nghiệp, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này báo cáo lần đầu tiên về việc sản xuất và đặc tính hóa một enzyme tyrosinase được tiết ra từ nấm sợi Trichoderma reesei. Enzyme này, được mã hóa bởi gen tyr2, đã được biểu hiện quá mức trong vật chủ tự nhiên và được tiết ra vào môi trường nuôi cấy. Quá trình tinh chế đã dẫn đến việc thu được một protein có khối lượng phân tử thấp hơn đáng kể so với dự đoán ban đầu, cho thấy quá trình xử lý C-terminal. Enzyme đã được đặc tính hóa về hoạt tính, độ ổn định trong các điều kiện pH và nhiệt độ khác nhau, cũng như ái lực và khả năng thay đổi cơ chất. Kết quả cho thấy T. reesei TYR2 hoạt động tối ưu ở pH trung tính đến kiềm, ổn định ở nhiệt độ lên tới 30°C và thể hiện ái lực cao với các cơ chất như L-dopa, p-coumaric acid và p-tyrosol. Khả năng thay đổi cơ chất của enzyme này rất rộng, cho phép nó oxy hóa cả các monophenol và diphenol, đồng thời cho thấy tính đặc hiệu lập thể.

Mục lục chi tiết:

• Production and characterization of a secreted, C-terminally processed tyrosinase from the filamentous fungus Trichoderma reesei
• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Introduction
• Results
• Isolation of a tyrosinase gene from Trichoderma reesei
• Overexpression of the tyrosinase gene in Trichoderma reesei
• Purification of T. reesei TYR2
• Biochemical characterization
• Discussion
• Experimental procedures
• Isolation of the tyrosinase gene from Trichoderma reesei
• Overexpression of the tyrosinase gene in Trichoderma reesei
• Protein and enzyme activity assays
• Enzyme purification
• Determination of isoelectric point
• Kinetic parameters, pH optimum and stability and thermal inactivation
• Stereospecificity and substrate specificity
• Oxidation of model peptides
• Inhibition
• Reversed-phase chromatography, alkylation and tryptic digestion
• MS
• Protein and peptide sequencing
• Chemical cleavage with cyanogen bromide
• Purification and analysis of glycopeptides
• Acknowledgements
• References