Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu xây dựng phương pháp multiplex PCR xác định một số tác nhân gây nhiễm khuẩn huyết

Nghiên Cứu Xây Dựng Phương Pháp Multiplex PCR Xác Định Một Số Tác Nhân Gây Nhiễm Khuẩn Huyết

Tác giả: Phạm Thị Thùy

Lĩnh vực: Sinh học thực nghiệm

Nội dung tài liệu:

Luận văn này tập trung vào việc nghiên cứu và phát triển phương pháp Multiplex PCR nhằm xác định nhanh chóng các tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Nhiễm khuẩn huyết là một bệnh lý toàn thân nghiêm trọng, có nguy cơ tử vong cao, đòi hỏi việc chẩn đoán sớm và chính xác để điều trị kịp thời. Phương pháp cấy máu truyền thống tuy phổ biến nhưng còn nhược điểm về thời gian và khả năng cho kết quả âm tính giả. Do đó, việc phát hiện DNA vi khuẩn bằng các kỹ thuật phân tử như Multiplex PCR, có khả năng phát hiện đồng thời nhiều loại tác nhân gây bệnh, được xem là một giải pháp tiềm năng. Nghiên cứu này nhằm mục đích lựa chọn và thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết phổ biến, tối ưu hóa điều kiện phản ứng Multiplex PCR, và thử nghiệm phương pháp trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nhiễm khuẩn huyết.

Mục lục chi tiết:

• MỞ ĐẦU
• CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
• 1.1. Nhiễm khuẩn huyết
• 1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam
• 1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết
• 1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thường gặp
• 1.2.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus
• 1.2.2. Acinetobacter baumannii
• 1.2.3. Klebsiella pneumoniae
• 1.2.4. Pseudomonas aeruginosa
• 1.2.5. Escherichia coli
• 1.3. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết
• 1.3.1. Chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết bằng phương pháp cấy máu
• 1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ
• 1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA
• 1.3.4. Giải trình tự
• 1.4. Multiplex PCR và ứng dụng
• 1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR
• 1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR
• 1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR
• 1.4.4. Ưu điểm của phương pháp multiplex PCR
• 1.4.5. Tối ưu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR
• 1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR
• 1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết
• CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
• 2.1. Vật liệu
• 2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
• 2.1.2. Thiết bị
• 2.2. Phương pháp nghiên cứu
• 2.2.1. Thiết kế primer
• 2.2.2. Tách chiết DNA
• 2.2.3. Phương pháp làm giàu DNA vi khuẩn
• 2.2.4. Xác định nồng độ DNA
• 2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose
• 2.2.6. Phương pháp PCR
• 2.2.7. Phương pháp giải trình tự gen
• 2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
• CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
• 3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích
• 3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm
• 3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn
• 3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích
• 3.2.3. Kết quả xác định trình tự các sản phẩm PCR từ các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae và Pseudomonas aeruginosa
• 3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi
• 3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR
• 3.3. Kết quả tối ưu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích
• 3.3.1. Kết quả tối ưu nồng độ mồi của phản ứng multiplex PCR
• 3.3.2. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR
• 3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR
• 3.4. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần
• 3.5. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm
• 3.5.1. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
• 3.5.2. Kết quả thử nghiệm phương pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng
• KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
• TÀI LIỆU THAM KHẢO
• PHỤ LỤC