Báo cáo khoa học: Methylthioadenosine phosphorylase from the archaeon Pyrococcus furiosus

Methylthioadenosine phosphorylase from the archaeon Pyrococcus furiosus: Mechanism of the reaction and assignment of disulfide bonds

Tác giả: Giovanna Cacciapuoti, Maria Angela Moretti, Sabrina Forte, Assunta Brio, Laura Camardella, Vincenzo Zappia, and Marina Porcelli

Lĩnh vực: Biochemistry, Biophysics

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả việc phân lập, biểu hiện và tinh sạch enzyme 5′-methylthioadenosine phosphorylase (PfMTAP) từ vi khuẩn cổ đại cực nóng Pyrococcus furiosus. Enzyme được biểu hiện ở mức độ cao trong Escherichia coli và được tinh sạch bằng phương pháp kết tủa nhiệt và sắc ký ái lực. Phân tích động học cho thấy phản ứng tuân theo cơ chế Bi-Bi có trật tự, trong đó phosphate liên kết trước nucleoside theo hướng phosphorolytic. PfMTAP là một protein lục phân với năm gốc cysteine mỗi đơn vị phụ, và nghiên cứu đã xác định hai cầu disulfide nội đơn vị. Enzyme thể hiện tính ổn định nhiệt cực cao và khả năng chống lại sự biến tính hóa học, với các cầu disulfide đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc và chức năng của protein.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Results and Discussion
• Analysis of the gene, cloning, expression and purification
• Protein fragmentation with CNBr and peptide mapping
• N-Terminal sequencing and mass spectrometric analysis
• Assignment of disulfide bridges
• Mechanism of the reaction
• Equilibrium studies of GdmCl-induced unfolding and refolding
• References