Location of the Bombyx mori 175 kDa cadherin-like protein-binding site on Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin

Location of the Bombyx mori 175 kDa cadherin-like protein-binding site on Bacillus thuringiensis Cry1Aa toxin

Tác giả: Shogo Atsumi, Yukino Inoue, Takahisa Ishizaka, Eri Mizuno, Yasutaka Yoshizawa, Madoka Kitami, and Ryoichi Sato

Lĩnh vực: Sinh học phân tử, Côn trùng học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định vị trí tương tác giữa độc tố Cry1Aa của Bacillus thuringiensis và protein thụ thể BtR175 từ tằm Bombyx mori. Các thí nghiệm sử dụng kháng thể đơn dòng và các protein tái tổ hợp để xác định các vùng tương tác cụ thể trên độc tố Cry1Aa. Kết quả cho thấy vị trí gắn kết của BtR175 trên Cry1Aa nằm gần vị trí gắn kết của thụ thể BmAPN1 và có vai trò thiết yếu trong độc tính của Cry1Aa đối với tằm. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng một số đột biến axit amin, đặc biệt là tại Tyr445, có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng gắn kết và độc tính của Cry1Aa.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Results
• Competitive binding of glutathione S-transferase (GST) 27 kDa BtR175 and GST 7 kDa BmAPN1 to Cry1Aa toxin
• Determination of binding compatibility for GST 27 kDa BtR175, GST 7 kDa BmAPN1, and mAb 1B10, using an IAsys optical sensor
• Monoclonal antibodies that block the binding of Cry1Aa toxin to GST 27 kDa BtR175
• Binding of mAbs 2A11 and 2F9 to Cry toxins
• Comparison of the domain II regions of Cry1Aa1, Cry1Ab8, Cry1Ac1 and Cry9Da2 toxins
• Expression and stability of Cry1Aa toxin Cys-substitution mutants
• Binding of Cry1Aa toxin constructs to GST 27 kDa BtR175
• Effects of mAbs that inhibit binding of Cry1Aa toxin to receptors on toxicity
• The effect of substituting Tyr445 for Cys on the toxicity of Cry1Aa toxin
• Discussion
• Locational relationship between the BmAPN1-binding site and the BtR175-binding site
• The location of the mAb 2A11 epitope that blocks binding of Cry1Aa toxin to GST 27 kDa BtR175
• Region in which the amino acid substitution influences the binding of Cry1Aa toxin to BtR175
• Experimental procedures
• Preparation of GST 7 kDa BmAPN1 and GST 27 kDa BtR175
• Preparation of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry9Da2 toxins
• Biotinylation of Cry1Aa toxin
• Competitive binding assay using ELISA plate
• Immobilization of Cry1Aa toxin on the sensing surface of a biosensor
• Determination of binding compatibility for BtR175, BmAPN1 and mAb 1B10 using the IAsys optical sensor
• Preparation of hybridomas and monoclonal antibodies against Cry1Aa toxin
• Immunoblotting
• Site-directed mutagenesis
• Introduction of small blocking molecules into single-Cys-substitution Cry1Aa toxin mutants
• Immobilization of BtR175 on the sensing surface of a biosensor
• Binding of Cry1Aa toxin constructs to GST 27 kDa BtR175
• Insects
• Bioassay
• Acknowledgement
• References