Báo cáo khoa học: Irreversible cross-linking of heme to the distal tryptophan of stromal ascorbate peroxidase in response to rapid inactivation by H2O2

Irreversible cross-linking of heme to the distal tryptophan of stromal ascorbate peroxidase in response to rapid inactivation by H2O2

Tác giả: Sakihito Kitajima, Taise Shimaoka, Miyo Kurioka và Akiho Yokota

Lĩnh vực: Sinh hóa, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc làm sáng tỏ cơ chế bất hoạt nhanh chóng của enzyme ascorbate peroxidase (APX) ở lục lạp khi tiếp xúc với hydrogen peroxide (H2O2). Phát hiện chính cho thấy heme, một thành phần thiết yếu trong vị trí xúc tác của APX, liên kết chéo một cách không thể đảo ngược với tryptophan ở vị trí xa (distal tryptophan). Sự biến đổi này, xảy ra trong vòng vài phút khi nồng độ chất nền khử (ascorbate) bị cạn kiệt, dẫn đến sự bất hoạt enzyme. Các thí nghiệm trên APX biến đổi gen (tsAPXW35F) cho thấy việc thay thế tryptophan này bằng phenylalanine đã ngăn chặn sự liên kết chéo và tăng đáng kể thời gian bán hủy bất hoạt. Điều này chỉ ra rằng sự hình thành liên kết chéo giữa heme và tryptophan là yếu tố chính gây ra sự bất hoạt APX nhanh chóng. So với các peroxidase chịu H2O2 khác, APX ở lục lạp có vẻ dễ bị tấn công bởi các gốc tự do hình thành trong quá trình trung gian phản ứng, dẫn đến sự liên kết chéo này.

Mục lục chi tiết:

• H2O2-mediated inactivation of stromal APX
• Results
• Irreversible cross-linking of heme to apoprotein in H2O2-inactivated stromal APX
• Identification of the heme-binding amino-acid residue in H2O2-inactivated stromal APX
• Effect of Trp35 mutation
• Discussion
• Experimental procedures
• Preparation of recombinant APXs
• Enzyme assay
• HPLC and MS
• Acknowledgements
• References