In vitro characterization of Synechocystis CYP120A1 revealed the first nonanimal retinoic acid hydroxylase

In Vitro Characterization Of Synechocystis Cyp120a1 Revealed The First Nonanimal Retinoic Acid Hydroxylase

Tên đề tài: In vitro characterization of Synechocystis CYP120A1 revealed the first nonanimal retinoic acid hydroxylase

Tác giả: Adrian Alder, Peter Bigler, Danièle Werck-Reichhart and Salim Al-Babili

Lĩnh vực: Biology, Institute of Biology II, Albert-Ludwigs University of Freiburg, Germany; Department of Chemistry and Biochemistry, NMR Laboratory, University of Bern, Switzerland; Institute of Plant Molecular Biology, CNRS-UPR2357, University of Strasbourg, France

Nội dung tài liệu:

Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định phản ứng xúc tác bởi enzyme CYP120A1 từ Synechocystis và khám phá tính đặc hiệu cơ chất của nó trong điều kiện in vitro. Enzyme CYP120A1, được biểu hiện trong vi lạp thể nấm men, đã chuyển hóa axit all-trans-retinoic thành một hợp chất có độ phân cực cao hơn khi phân tích bằng HPLC. Phân tích LC-MS cho thấy có sự gắn một nhóm hydroxyl đơn lẻ, và phân tích NMR của sản phẩm tinh chế đã xác định vị trí phản ứng là C16 hoặc C17. Các thử nghiệm với các cis-retinoic acid, retinal, 3(R)-OH-retinal, retinol, β-apo-13-carotenone (C18) và β-apo-14′-carotenal (C22) đều dẫn đến sự hình thành các dẫn xuất hydroxyl tương ứng. So sánh lượng sản phẩm tương đối cho thấy tỷ lệ chuyển hóa cao nhất đối với axit all-trans-retinoic, tiếp theo là β-apo-13-carotenone (C18). Nghiên cứu RT-PCR theo thời gian thực cho thấy CYP120A1 được biểu hiện trong điều kiện sinh trưởng bình thường và tăng nhẹ dưới ánh sáng cường độ cao. Công trình này cung cấp nghiên cứu enzyme đầu tiên về một cytochrome P450 từ vi khuẩn lam, cho thấy đây là enzyme đầu tiên có nguồn gốc phi động vật thực hiện chuyển hóa axit retinoic. Hơn nữa, phản ứng do CYP120A1 xúc tác đại diện cho một phương thức biến đổi mới đối với các retinoid.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Results
• Cloning and heterologous expression of CYP120A1
• In vitro assays with retinoic acids
• NMR analyses
• In vitro assays with other all-trans-retinoids
• In vitro assays with other all-trans-apocarotenoids
• Expression analysis of CYP120A1 in Synechocystis
• Discussion
• Experimental procedures
• Cloning and plasmid construction
• Heterologous expression of CYP120A1
• Preparation of microsomes
• Enzymatic assays
• Analytical methods
• Preparative HPLC
• NMR spectroscopy
• TaqMan real-time RT-PCR
• Acknowledgements
• References
• Supporting information