Báo cáo Y học: Identification and characterization of a new gene from Variovorax paradoxus Iso1 encoding N -acyl-D-amino acid amidohydrolase responsible for D-amino acid production

Identification and characterization of a new gene from Variovorax paradoxus Iso1 encoding N-acyl-D-amino acid amidohydrolase responsible for D-amino acid production

Tác giả: Pei-Hsun Lin, Shiun-Cheng Su, Ying-Chieh Tsai and Chia-Yin Lee

Lĩnh vực: Sinh hóa, Hóa sinh nông nghiệp

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả việc xác định và đặc tính hóa một gen mới từ chủng vi khuẩn Variovorax paradoxus Iso1, gen này mã hóa enzyme N-acyl-D-amino acid amidohydrolase (N-D-AAase). Enzyme này có vai trò quan trọng trong việc sản xuất D-amino acid, một thành phần thiết yếu trong tổng hợp hóa học chiral cho nhiều ứng dụng công nghiệp, bao gồm cả kháng sinh bán tổng hợp và peptide hoạt tính sinh học. Gen N-D-AAase đã được phân lập, giải trình tự và biểu hiện tái tổ hợp trong Escherichia coli. Enzyme tái tổ hợp đã được tinh chế và đặc tính hóa, cho thấy hoạt tính thủy phân cao đối với các dẫn xuất N-acyl-D-amino acid, đặc biệt là các dẫn xuất chứa D-methionine, D-leucine và D-alanine, đồng thời thể hiện tính đặc hiệu chiral rõ rệt đối với đồng phân L.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and Methods
• Bacterial strains, plasmids and conditions
• Materials, enzymes and chemicals
• 16S rDNA gene sequence analysis
• Cloning of V. paradoxus N-D-AAase gene
• Southern analysis
• Nucleotide and amino acid sequence analysis
• Construction of a plasmid to produce the recombinant protein N-D-AAase in the E. coli
• Expression and purification of the N-D-AAase from the E. coli transformant
• Enzyme activity assay
• SDS/PAGE and Western analysis
• Peptide sequencing by LC/MS/MS analysis and isoelectric focusing
• Influences of temperature and pH on enzyme activity
• Influences of chelating reagents and metal ion on enzyme activity
• Substrate specificity analysis
• Results
• Identification and phylogenetic analysis of the strain Iso1
• Cloning and nucleotide sequencing analysis of the N-D-AAase from V. paradoxus Iso1
• Sequence comparison of the V. paradoxus N-D-AAase protein
• Expression and purification of the N-D-AAase protein from E. coli Top10
• Optimal temperature and thermostability of N-D-AAase
• Optimal pH and pH stability of N-D-AAase protein
• Influences of chelating reagents and metal ions on enzyme activity
• Substrate specificity analysis
• Discussion
• Acknowledgements
• References