Báo cáo khoa học: Comparative metal binding and genomic analysis of the avian (chicken) and mammalian metallothionein

Comparative metal binding and genomic analysis of the avian (chicken) and mammalian metallothionein

Tác giả: Laura Villarreal, Laura Tío, Mercè Capdevila, Sílvia Atrian

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích khả năng liên kết kim loại của metallothionein (MT) ở gà (ckMT) và so sánh với các dạng MT ở động vật có vú, cụ thể là MT1 và MT4. Các tác giả đã xem xét lại kỹ lưỡng khả năng liên kết Zn(II), Cd(II) và Cu(I) của ckMT, đồng thời khám phá một cơ chế mới về sự dime hóa MT dựa trên khả năng phối trí của histidine ở đầu C của ckMT. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn tiến hành phân tích bộ gen và protein MT của các loài chim. Kết quả cho thấy ckMT có khả năng liên kết kim loại nằm giữa MT1 và MT4 của động vật có vú, gần với MT1 hơn đối với ion kim loại hóa trị hai, nhưng tương tự MT4 hơn đối với Cu(I). Nghiên cứu cũng xác định được một gen MT thứ hai ở gà, ckMT2, có khả năng mã hóa chức năng. Các phát hiện này cung cấp cái nhìn mới về khả năng liên kết kim loại của MT ở động vật có xương sống máu nóng và mối quan hệ tiến hóa của chúng.

Mục lục chi tiết:

• Results and discussion
• Metal binding analysis rationale
• Zn(II) and Cd(II) binding abilities of ckMT and its separate domains
• Fig. 1. Comparison of the CD spectra of the biosynthesized (A) Zn-ckMT (solid grey line), Zn4-ackMT (dotted line) and Zn-ẞckMT (dashed line); (B) Cd-ckMT (solid grey line), Cd-ackMT (dotted line) and Cd-ẞckMT (dashed line). The spectra depicted in a solid black line in (A) and (B) represent the sum of the CD spectra of M-ackMT and M-ẞckMT; (C) Zn-ẞckMT (solid black line), Zn-ẞMT4 (solid grey line), Zn3-BMT1 (dashed line) and Zn-ẞckMT reneutralized (dotted line); (D) Cd-ẞckMT (solid black line), Cd-ẞMT4 (solid grey line) and Cd3-BMT1 (dashed line).
• Fig. 2. (A) and (B) CD spectra corresponding to the titration of Zn-ẞckMT with Cd(II) at pH 7. The arrows show the evolution of the spectra when the indicated number of Cd(II) equivalents were added. (C) Superimposition of the spectra recorded after 3 Cd(II) added to Zn-ẞckMT (solid grey line) and the spectra of the biosynthesized Cd-ẞckMT (solid black line). (D) Comparison of the in vitro constituted Cd3-BMT complexes of ẞckMT (solid black line), ẞMT4 (dashed line [16]), and BMT1 (dotted line [18] and note 2 in supplementary material).
• Fig. 3. (A) CD and UV-vis difference spectra corresponding to the titrations of Zn-ckMT and Zn4-ackMT with Cd(II) at pH 7. Arrows show the evolution of the spectra when the indicated number of Cd(II) was added. (B) CD spectrum of the acidification of the final solution of the Cd(II) titration of Zn-ckMT, the arrow shows the evolution from pH 7 to 4. (C) ESI-MS spectra of an aliquot of the solution obtained after adding 7 Cd(II) to Zn4-ackMT.
• Scheme 1. Possible mechanism of dimerization. The Cd-NHis dashed bonds in (1) are broken when those of (2) are formed.
• Fig. 4. CD spectra of the recombinant (A) Zn3Cu7-ckMT (black solid line), Zn3Cu7-MT4 (dashed line) and Zn3Cu7-MT1 (dotted line); (B) Cu-ackMT (black solid line), Cu-aMT4 (dashed line) and Cu-aMT1 (dotted line); and (C) Cu-ẞckMT (black solid line), Cu-ẞMT4 (dashed line) and Cu-BMT1 (dotted line).
• Chicken genome search, comparative genomics and protein sequence analysis
• Fig. 5. Structure and synteny of the chicken, mouse and human genomic regions containing the MT genes. The chromosome number and bands enclosing the MT cluster are indicated for the mammalian genomes. For the chicken genome, the name of the corresponding contig is shown, as well as of the known chromosome. Two genes external to the MT cluster have been used as flanking synteny markers.
• Fig. 6. (A) ClustalW alignment of the known avian MT sequences, and the MT1 (P02802) and MT4 (P47945) mammalian forms. The shaded boxes indicate the cysteine residues. The avMTa sequence corresponds to the MT of Gallus gallus 1 (P68497), Cairina moschata (P68495), Meleagris gallopavo (P68498), Anas platyrhynchos (P68494) and Coturnix japonica (Q5G1K5). The avMTb is the Columba livia 2 isoform (P15787). The avMTc sequence is found in the Columba livia 1 (P15786) and Gallus gallus 2 isoforms. For avMTb and avMTc only the residues differing from avMTa are shown. (B) Protein distance tree constructed with the amino acid sequences of the avian MT isoforms, the mammalian MT1, MT2 (P02798) and MT4 isoforms, the fish MTs of genera Rutilus (P80593), Danio (P52722) and Barbatula (P25128), and the amphibian Ambystoma MT (042152). The bootstrap values of the branching points are indicated. The sequence accession numbers in the UniProtKB/Swiss-Prot databank are indicated in parentheses.
• Conclusions
• Experimental procedures
• Bacterial strains and plasmids
• Synthesis and purification of the ckMT, ackMT and ẞckMT metal complexes
• Analysis of the ckMT, ackMT and ẞckMT metal content
• GC determination of the sulphide content in the ckMT, ackMT and ẞckMT metal complexes
• In silico analysis of the chicken genome and avian MT protein sequences
• Acknowledgements
• References
• Supplementary material