Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 11 trang
Dung lượng: 183 KB

Giới thiệu nội dung

Characterization of rat cathepsin E and mutants with changed active-site residues and lacking propeptides and N-glycosylation, expressed in human embryonic kidney 293T cells

Tác giả: Takayuki Tsukuba, Shinobu Ikeda, Kuniaki Okamoto, Yoshiyuki Yasuda, Eiko Sakai, Tomoko Kadowaki, Hideaki Sakai, Kenji Yamamoto

Lĩnh vực: Dược lý, Sinh hóa

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc tìm hiểu vai trò của hoạt tính xúc tác, propeptide và N-glycosyl hóa của enzyme cathepsin E nội bào trong quá trình sinh tổng hợp, xử lý và vận chuyển nội bào. Các nhà nghiên cứu đã tạo ra các dạng đột biến của cathepsin E chuột, bao gồm cả những đột biến thay đổi các gốc axit amin tại vị trí hoạt động và những đột biến thiếu propeptide cùng N-glycosyl hóa. Enzyme cathepsin E loại hoang dã khi biểu hiện trong tế bào thận người nguyên phát HEK-293T chủ yếu được tìm thấy trong các bào quan nội thể dương tính với LAMP-1. Phân tích pulse-chase cho thấy pro-cathepsin E ban đầu được xử lý thành enzyme trưởng thành trong vòng 24 giờ. Quá trình này bị ức chế hoàn toàn bởi brefeldin A và bafilomycin A, cho thấy sự vận chuyển từ lưới nội chất (ER) đến khoang axit của nội thể. Các dạng đột biến với gốc axit amin Asp tại hai motif vị trí hoạt động bị thay đổi thành Ala và thiếu propeptide (Leu23-Phe58) cùng trình tự ER-retention giả định (Ser59-Asp98) đã không được xử lý hoặc vận chuyển đến khoang nội thể. Đột biến thiếu trình tự ER-retention bị phân hủy nhanh chóng trong ER, cho thấy tầm quan trọng của trình tự này đối với sự gấp cuộn đúng. Các đột biến thiếu N-glycosyl hóa đơn lẻ (N92Q hoặc N324D) và kép (N92Q/N324D) cũng không được xử lý thành dạng trưởng thành hay vận chuyển đến khoang nội thể, mà bị giữ lại ổn định trong ER mà không bị phân hủy. Dữ liệu này cho thấy hoạt tính xúc tác, propeptide và N-glycosyl hóa của protein này đều thiết yếu cho quá trình xử lý, trưởng thành và vận chuyển của nó.

Mục lục chi tiết:

  • Introduction
  • Materials and Methods
  • Experimental Procedures
  • Plasmid construction and mutagenesis
  • Tissue culture and transfection
  • Preparation of cell lysate and culture medium
  • Pulse-chase analysis
  • Immunoprecipitation
  • SDS/PAGE and immunoblotting
  • Endoglycosidase digestion
  • Immunofluorescence microscopy
  • References