Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 12 trang
Dung lượng: 214 KB

Giới thiệu nội dung

Application of a fluorescent cobalamin analogue for analysis of the binding kinetics

Tác giả: Sergey N. Fedosov, Charles B. Grissom, Natalya U. Fedosova, Søren K. Moestrup, Ebba Nexø, and Torben E. Petersen

Lĩnh vực: Protein Chemistry, Molecular Biology, Chemistry, Physiology and Biophysics, Medical Biochemistry, Clinical Biochemistry

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày việc ứng dụng một dẫn xuất cobalamin (Cbl) có gắn huỳnh quang, gọi là CBC, để phân tích động học liên kết với các protein vận chuyển là yếu tố nội tại (IF) và transcobalamin (TC). Việc gắn nhóm huỳnh quang rhodamine vào vị trí 5′ OH-ribose của Cbl đã tạo ra một đầu dò hiệu quả, cho phép theo dõi trực tiếp các phản ứng liên kết và phân ly. Kết quả cho thấy CBC có ái lực tương đương với Cbl khi gắn vào TC, nhưng phức tạp hơn khi tương tác với IF, đặc biệt là với các mảnh vỡ của IF. Phân tích động học chi tiết cho thấy CBC có thể được sử dụng làm tác nhân báo cáo trong các nghiên cứu động học liên kết, và có tiềm năng ứng dụng trong các nghiên cứu hình ảnh hóa sinh học.

Mục lục chi tiết:

  • Introduction
  • Keywords
  • Correspondence
  • Abstract
  • Cobalamin (Cbl, vitamin B12) is a cofactor…
  • Abbreviations
  • Application of a fluorescent Cbl analogue
  • Results
  • Preparation of the proteins
  • Synthesis of the fluorescent Cbl analogue CBC-244
  • Spectral properties of CBC
  • Binding of CBC to IF or TC
  • Binding of CBC to IF fragments IF20 or IF30
  • Association of the fragments IF20-CBC + IF30
  • Competitive binding of CBC and Cbl, calculation of k+
  • Dissociation of IF-CBC and IF-Cbl in ‘chase’ experiments
  • Dissociation of TC-ligand complexes
  • Dissociation of the cleaved IF-ligand complexes
  • Reliability of CBC-fluorescence method
  • Binding of IF-CBC and IF-Cbl to the specific receptor
  • Discussion
  • Experimental procedures
  • Materials
  • Methods
  • Expression and purification of human recombinant IF and TC
  • Synthesis of the fluorescent Cbl analogue CBC-244
  • Measurement of fluorescence spectra
  • Measurement of the binding kinetics with fluorescent probe CBC
  • Measurement of the dissociation kinetics with the fluorescent probe CBC
  • Measurement of the dissociation kinetics by absorbance method
  • Binding of IF to the receptor
  • Data processing
  • Acknowledgements
  • References