Báo cáo khoa học: A single intersubunit salt bridge affects oligomerization and catalytic activity in a bacterial quinone reductase

A Single Subunit Salt Bridge Affects Oligomerization and Catalytic Activity in a Bacterial Quinone Reductase

Tác giả: Alexandra Binter, Nicole Staunig, Ilian Jelesarov, Karl Lohner, Bruce A. Palfey, Sigrid Deller, Karl Gruber, and Peter Macheroux

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này khám phá vai trò của một cầu muối giữa các tiểu đơn vị trong enzyme YhdA, một NADPH:FMN oxidoreductase từ Bacillus subtilis. Enzyme này tồn tại dưới dạng tetramer ổn định, được duy trì bởi bốn cầu muối giữa Lys109 và Asp137 của các phân tử lân cận. Các biến thể protein đã được tạo ra bằng cách thay thế các axit amin này để điều tra tầm quan trọng của các tương tác ion. Kết quả cho thấy các biến thể thay thế đơn lẻ tạo thành dimer thay vì tetramer, trong khi các biến thể thay thế kép tồn tại trong trạng thái cân bằng dimer-tetramer. Điều thú vị là tất cả các biến thể protein đều cho thấy hoạt động quinone reductase giảm đáng kể, chủ yếu là do sự suy giảm trong phản ứng oxy hóa khử FMN với NADPH. Phân tích cấu trúc tinh thể cho thấy rằng Lys109 không chỉ tham gia vào việc hình thành cầu muối mà còn ổn định một vòng lặp giàu glycine gần nhóm cofactor FMN. Sự tăng tính di động của vòng lặp này trong các biến thể dường như cản trở việc gắn NADPH, dẫn đến mất khả năng khử flavin. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng tính ổn định nhiệt độ cao của YhdA không phụ thuộc vào trạng thái tetramer mà là một đặc tính nội tại của các protein đơn lẻ hoặc dimer.

Mục lục chi tiết:
(Trích xuất tự động từ file gốc)

• Structured digital abstract
• Keywords
• Correspondence
• Introduction
• Results
• Discussion
• Experimental procedures
• Reagents
• Cloning, recombinant expression and purification
• Site-directed mutagenesis
• Molecular mass determination
• Spectrophotometric methods
• Steady-state kinetics
• Determination of the stereospecificity of YhdA
• Stopped-flow kinetics
• Thermal unfolding experiments
• X-ray crystal structures
• Acknowledgements
• References
• Supporting information