Preparation and characterisation of attenuated cold-adapted influenza A reassortants derived from the A/Leningrad/134/17/57 donor strain

Preparation and Characterisation of Attenuated Cold-Adapted Influenza A Reassortants Derived from the A/Leningrad/134/17/57 Donor Strain

Tác giả: M.D. Wareing, G.A. Marsh, G.A. Tannock

Lĩnh vực: Biotechnology and Environmental Biology, RMIT University

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này mô tả và so sánh một phương pháp nuôi cấy tế bào mới để điều chế virus tái tổ hợp cúm A thích ứng lạnh (cold-adapted – ca) với phương pháp sử dụng trứng hiện tại. Các nhà nghiên cứu đã sử dụng hỗn hợp virus hiến tặng ca A/Leningrad/134/17/57-ca (A/Len/17) và chủng virus dịch cúm H3N2 gần đây A/Beijing/32/92 (A/Beij/32) để đồng nhiễm các nuôi cấy tế bào thận gà (CEK). Virus tái tổ hợp đã được chọn lọc bằng xét nghiệm trung tâm nhiễm. Phương pháp này có khả năng phát hiện sự cản trở, với tỷ lệ nhiễm của A/Len/17 và A/Beij/32 là 1:7. Các virus tái tổ hợp đã được đặc trưng về mặt di truyền bằng cách khuếch đại các vùng xác định trong mỗi gen nội tại bằng PCR và xác định sản phẩm bằng phân tích enzyme cắt. Các virus tái tổ hợp cũng được kiểm tra kiểu hình ca và nhạy cảm với nhiệt độ (ts), cũng như nhận dạng kháng nguyên bề mặt. Xét nghiệm trung tâm nhiễm cho thấy là một phương pháp hiệu quả để phân lập các virus tái tổ hợp mang kháng nguyên ngưng kết hồng cầu (haemagglutinin) và kháng nguyên kháng neuraminidase (neuraminidase) của A/Beij/32. Các virus tái tổ hợp với sáu gen nội tại có nguồn gốc từ chủng hiến tặng và mang kiểu hình ca và ts đã dễ dàng thu được khi sử dụng tỷ lệ nhiễm 1:49 và hai lần phân lập bằng plaque sau khi nuôi cấy ở 25°C và một lần ở 34°C, cả hai đều có sự hiện diện của huyết thanh chống chủng hiến tặng.

Mục lục chi tiết:

• 2. Materials and methods
• 2.1. Viruses
• 2.2. Cell culture medium
• 2.3. Reassortment of ca donor and wt epidemic influenza A viruses
• 2.3.1. Reassortment in embryonated eggs (method A)
• 2.3.2. Reassortment in CEK cells (methods B and C)
• 2.4. Infectious centre assays
• 2.5. Plaque assays
• 2.6. Haemagglutinin and haemagglutination inhibition (HI) assays
• 2.7. Neuraminidase inhibition (NI) assays
• 2.8. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)
• 2.9. Restriction analysis
• 2.10. Sequencing of RT-PCR products
• 3. Results
• 3.1. Preparation of cold-adapted reassortant viruses in CEK cells
• 3.2. Cloning of reassortant progeny
• 3.2.1. Cloning in embryonated eggs
• 3.2.2. Cloning in CEK cultures (methods B and C)
• 3.3. Tests for ca and ts phenotype
• 3.4. Genetic characterisation
• 4. Discussion