Xem trước tài liệu

Đang tải tài liệu...

Thông tin chi tiết tài liệu

Định dạng: PDF
Số trang: 13 trang
Dung lượng: 255 KB

Giới thiệu nội dung

N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line

Tác giả: Guillermina Forno, Mariela Bollati Fogolin, Marcos Oggero, Ricardo Kratje, Marina Etcheverrigaray, Harald S. Conradt, Manfred Nimtz

Lĩnh vực: Sinh hóa, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu:
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích cấu trúc các carbohydrate liên kết N và O, cũng như mức độ chiếm dụng các vị trí glycosyl hóa trên yếu tố kích thích tăng sinh dòng bạch cầu hạt-đại thực bào (GM-CSF) tái tổ hợp được tiết ra từ dòng tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc (CHO). Các nhà nghiên cứu đã so sánh hai dạng GM-CSF được sản xuất từ nuôi cấy tế bào dạng huyền phù và dạng bám dính. Phương pháp phân tích bao gồm sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược với phát hiện điện hóa xung (HPAEC-PAD) và khối phổ thời gian bay ion hóa laser (MALDI-TOF MS). Kết quả cho thấy cả hai dạng GM-CSF đều có cấu trúc oligosaccharide phức tạp, chủ yếu là chuỗi tri- và tetraantennary, với sự hiện diện của gốc fucose liên kết alpha-1,6. Nghiên cứu cũng xác định được mức độ chiếm dụng của các vị trí glycosyl hóa N và O, với bằng chứng cho thấy vị trí glycosyl hóa N ở Asn37 được chiếm dụng cao hơn so với Asn27. Các dạng O-glycosyl hóa cũng được xác định tại các vị trí Ser7, Ser9 và Thr10. Sự khác biệt về tỷ lệ các dạng có một vị trí glycosyl hóa N bị chiếm dụng đã được quan sát giữa hai phương pháp nuôi cấy, cho thấy quy trình sản xuất có thể ảnh hưởng đến đặc điểm glycosyl hóa.

Mục lục chi tiết:

  • N- and O-linked carbohydrates and glycosylation site occupancy in recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor secreted by a Chinese hamster ovary cell line
  • Authors
  • Affiliations
  • Abstract
  • Keywords
  • Correspondence
  • Abbreviations
  • Enzymes
  • Materials and methods
  • Cell Factory
  • Establishment of a human GM-CSF secreting stable cell
  • Cell culture
  • Production in spinner flasks
  • Production in a Multi-Tray system
  • Analysis of culture samples
  • rhGM-CSF purification
  • SDS/PAGE and analytical isoelectric focusing
  • Oligosaccharide preparation for analysis
  • Chemical removal of sialic acid
  • Reduction, carboxamidomethylation and endo Glu-C digestion of GM-CSF samples
  • In-gel tryptic digestion of GM-CSF
  • High-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection
  • Preparation of GM-CSF protein samples for mass spectrometry analysis
  • Analysis by MALDI-TOF MS
  • Electrospray ionization MS
  • Results
  • GM-CSF production
  • Purification of the secreted rhGM-CSF proteins
  • SDS/PAGE and isoelectric focusing of GM-CSF preparations
  • Analysis of N-linked carbohydrate chains
  • HPAEC-PAD mapping of N-oligosaccharides
  • Oligosaccharide analysis by MALDI-TOF MS
  • Antennarity of oligosaccharides within the mono-, di-, tri- and tetrasialylated fractions
  • O-glycosylation of the GM-CSF polypeptide
  • MALDI-TOF MS analysis of the GM-CSF proteins
  • Site specific glycosylation of GM-CSF
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • References