Báo cáo khóa học: Heterogeneity of homologously expressed Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei ) Cel7B catalytic module

Heterogeneity of Hypocrea jecorina (Trichoderma reesei) Cel7B catalytic module

Tác giả: Torny Eriksson, Ingeborg Stals, Anna Collén, Folke Tjerneld, Marc Claeyssens, Henrik Stålbrand, and Harry Brumer

Lĩnh vực: Hóa sinh, Kỹ thuật sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích sự không đồng nhất của mô-đun xúc tác của enzyme Cel7B từ nấm sợi Hypocrea jecorina (trước đây là Trichoderma reesei). Các phương pháp sắc ký, khối phổ và phân tích peptide đã được sử dụng để xác định các dạng glyco khác nhau của protein. Kết quả cho thấy rằng sự không đồng nhất chủ yếu là do hai vị trí N-glycosyl hóa (Asn56 và Asn182) mang các chuỗi N-glycan phức tạp, chủ yếu là high-mannose, với sự hiện diện của liên kết phosphodiester. Ngoài ra, sự không đồng nhất còn do một vị trí O-glycosyl hóa được chiếm dụng một phần và sự deamidation của asparagine. Các yếu tố này cùng nhau góp phần vào sự đa dạng của các dạng glyco được quan sát trong chế phẩm enzyme.

Mục lục chi tiết:

• Giới thiệu
• Nguyên liệu và phương pháp
• Sản xuất enzyme
• Sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao với phát hiện xung điện hóa (HPAEC-PAD)
• Phân tích khối phổ
• Tiêu hóa bằng Endoglycosidase H
• Xử lý bằng phosphatase kiềm
• Xử lý bằng α-mannosidase
• Thủy phân axit toàn phần
• Tiêu hóa bằng protease
• Kết quả
• Biểu hiện protein và tinh chế
• Phân tích PAG-IEF của Cel7Bcat nguyên vẹn và đã tiêu hóa bằng Endo H
• Phân tích ESI-MS của Cel7Bcat nguyên vẹn và đã tiêu hóa bằng Endo H
• Định danh các vị trí N-glycosyl hóa
• Phân tích Cel7BcatN182Q mutant
• Đặc trưng các N-glycan được giải phóng bằng Endo H
• O-glycosyl hóa
• Sự không đồng nhất trong Cel7Bcat do deamidation protein
• Thảo luận
• Sự không đồng nhất N-glycan trong Cel7Bcat
• Sự không đồng nhất O-glycan trong Cel7Bcat
• Sự không đồng nhất trong Cel7Bcat do deamidation protein
• Lời cảm ơn
• Tài liệu tham khảo
• Tài liệu bổ sung