Báo cáo khoa học: Amino acid biosynthesis and metabolic flux profiling of Pichia pastoris

Amino acid biosynthesis and metabolic flux profiling of Pichia pastoris

Tác giả: Aina Solà, Hannu Maaheimo, Katri Ylönen, Pau Ferrer, Thomas Szyperski

Lĩnh vực: Hóa sinh, Công nghệ sinh học

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc làm sáng tỏ quá trình sinh tổng hợp axit amin và chuyển hóa carbon trung tâm của nấm men Pichia pastoris thông qua phương pháp gắn nhãn 13C có hướng dẫn sinh tổng hợp. Các tế bào được nuôi cấy trong điều kiện nuôi cấy liên tục (chemostat) với glycerol hoặc glucose làm nguồn carbon duy nhất ở các tốc độ pha loãng khác nhau. Kết quả cho thấy các axit amin được tổng hợp tương tự như ở Saccharomyces cerevisiae, và quá trình sinh tổng hợp pyruvate qua enzyme malic không được ghi nhận. Nghiên cứu cũng chỉ ra sự vận chuyển oxaloacetate qua màng ty thể có tính hai chiều và sự gia tăng tỷ lệ tổng hợp anaplerotic oxaloacetate khi tăng tốc độ pha loãng. So sánh với các chủng P. stipitis và S. cerevisiae đã được nghiên cứu trước đó, dữ liệu ban đầu cho thấy sự điều hòa chuyển hóa carbon trung tâm ở P. pastoris và S. cerevisiae có thể tương đồng hơn.

Mục lục chi tiết:

• Amino acid biosynthesis and metabolic flux profiling of Pichia pastoris
• Keywords: 13C NMR; central metabolism; flux profiling; metabolic engineering; Pichia pastoris.
• Correspondence to P. Ferrer, Department of Chemical Engineering, Escola Tècnica Superior d’Enginyeria (E.T.S.E), Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Spain.
• Fax: +34 935 812013, Tel.: +34 935 812141, E-mail: pau.ferrer@uab.es and Thomas Szyperski, Department of Chemistry, University at Buffalo, The State University of New York at Buffalo, NY 14260, USA.
• Fax: + 1 716 6457338, Tel.: + 1 716 6456800 ext. 2245, E-mail: szypersk@chem.buffalo.edu
• Abbreviations: [13C, 1H]-COSY, [13C, 1H] correlation NMR spectroscopy; BDF, biosynthetically directed fractional; METAFOR, metabolic flux ratio; ROL, Rhizopus oryzae lipase; D, dilution rate; µmax, maximum specific growth rate; cyt, cytosolic; mt, mitochondrial; TCA, tricarboxylic acid; PEP, phosphoenolpyruvate; PPP, pentose phosphate pathway; PYR, pyruvate; OAA, oxaloacetate; SHMT, serine hydroxymethyltransferase; GCV, glycine cleavage pathway; ICL, isocitrate lyase; MS, malate synthase.
• Enzymes: alanine:glyoxylate amino transferase (EC 2.6.1.44), glycine cleavage system (EC 2.1.2.10), glycerol kinase (EC 2.7.1.30), FAD-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase (EC 1.1.99.5), isocitrate lyase (EC 4.1.3.1), lipase [triacylglycerol acylhydrolase] (EC 3.1.1.3), malic enzyme (EC 1.1.1.39/1.1.40), malate synthase (EC 2.3.3.9), pyruvate carboxylase (EC 6.4.1.1), phosphoenolpyruvate carboxykinase (EC 4.1.1.49), serine hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1), succinate dehydrogenase (EC 1.1.1.42), threonine aldolase (EC 4.1.2.5), transaldolase (EC 2.2.1.2), transketolase (EC 2.2.1.1).
• (Received 19 December 2003, revised 23 March 2004, accepted 20 April 2004)
• The methylotrophic yeast Pichia pastoris has emerged as an important host for heterologous protein expression in both biomedical research and industrial biotechnology [1,2].
• Materials and methods
• Strain and media
• Chemostat cultivations
• Analytical procedures
• Results and discussion
• Biosynthesis of proteinogenic amino acids and C1 metabolism in P. pastoris
• Central carbon metabolism of P. pastoris growing on glycerol in chemostats
• Fig. 1. Network of active biochemical pathways constructed for P. pastoris cells grown with either glycerol or glucose as the sole carbon source.
• Fig. 2. Summary of flux information involving the pools of TCA intermediates when P. pastoris cells are grown in a chemostat.
• Comparative profiling of P. pastoris grown on glycerol and glucose
• Table 1. Growth parameters at steady state chemostat cultivations of P. pastoris.
• Table 2. Relative abundances of intact C2 and C3 fragments in proteinogenic amino acids.
• Table 3. Origins of metabolic intermediates during aerobic growth of P. pastoris in glycerol chemostat cultures at D = 0.05 h⁻¹ and D = 0.16 h⁻¹, and in glucose chemostat culture at D = 0.16 h⁻¹.
• Conclusions
• Acknowledgements
• References