Báo cáo khoa học: Intrinsically active variants of all human p38 isoforms

Intrinsically Active Variants of All Human P38 Isoforms

Tác giả: Michal Avitzour, Ron Diskin, Bilha Raboy, Nadav Askari, David Engelberg, and Oded Livnah

Lĩnh vực: Biological Chemistry, Structural Biology, Life Sciences

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này trình bày việc phát triển và đặc tính hóa các biến thể đột biến có hoạt tính nội tại của tất cả bốn dạng p38 ở người (p38α, p38β, p38γ, và p38δ). Các biến thể này được thiết kế dựa trên hiểu biết về cấu trúc và cơ chế hoạt hóa của các dạng p38 và Hog1 của nấm men. Các đột biến được nhắm mục tiêu vào các vùng quan trọng, đặc biệt là vòng L16, nơi các thay đổi cấu trúc được cho là thúc đẩy hoạt hóa. Nghiên cứu đã thành công trong việc tạo ra các biến thể hoạt động nội tại cho tất cả các dạng p38, cho phép tự phosphoryl hóa và hoạt động mà không cần kích hoạt từ các yếu tố bên ngoài. Các biến thể mới này duy trì tính đặc hiệu đối với các chất nền và chất ức chế tương tự như protein dạng hoang dã, và có thể là công cụ mạnh mẽ để làm sáng tỏ cơ chế hoạt hóa và vai trò sinh học cụ thể của từng dạng p38. Nghiên cứu cũng khám phá các khía cạnh về đặc tính động học, tính đặc hiệu của chất nền và phản ứng với các chất ức chế của các biến thể này.

Mục lục chi tiết:

• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Introduction
• Results
• Design of the active mutants
• Activity assay of the mutants
• The active mutants maintained substrate specificity and sensitivity to inhibitors of the parental proteins
• Discussion
• State of phosphorylation and autophosphory-lation capabilities of p38βD176A and p388F324S active mutants
• Experimental procedures
• Rational design of p38α, p38β and p38δ single mutants
• Subcloning and site-directed mutagenesis of p38α, p38β and p38δ
• Protein expression and purification
• Kinase assay
• Inhibition of kinase activity by SB203580 or PD169316
• Paper spot kinase assays
• Western blot
• Acknowledgements
• References