Báo cáo khoa học: Reaction of human UMP-CMP kinase with natural and analog substrates

Reaction of Human UMP-CMP Kinase with Natural and Analog Substrates

Tác giả: Claudia Pasti, Sarah Gallois-Montbrun, Hélène Munier-Lehmann, Michel Veron, Anne-Marie Gilles, and Dominique Deville-Bonne

Lĩnh vực: Hóa sinh, Sinh học phân tử

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tái khảo sát hoạt tính của enzyme UMP-CMP kinase người đối với các cơ chất tự nhiên và các chất tương tự nucleoside. Enzyme này đóng vai trò quan trọng trong quá trình phosphoryl hóa UTP, CTP và dCTP, cũng như trong quá trình phosphoryl hóa các chất tương tự nucleoside được sử dụng trong liệu pháp kháng virus. Các tác giả đã cải thiện biểu hiện và điều kiện ổn định của enzyme tái tổ hợp. Nghiên cứu đã quan sát thấy sự ức chế cơ chất đối với UMP và CMP ở nồng độ cao hơn 0.2 mM, nhưng không có ở dCMP. Chất tương tự kháng virus L-3TCMP được xác định là một cơ chất hiệu quả, được phosphoryl hóa thành L-3TCDP bởi enzyme UMP-CMP kinase người. Tuy nhiên, trong phản ứng ngược, enzyme không xúc tác cho việc gắn thêm nhóm phosphate thứ ba vào L-3TCDP, mà chất này hoạt động như một chất ức chế. Thông qua mô hình hóa phân tử, L-3TCMP được xây dựng trong vị trí hoạt động của enzyme từ Dictyostelium. Enzyme UMP-CMP kinase người có ái lực chọn lọc đối với vị trí tiếp nhận nucleoside monophosphate, nhưng bị giới hạn đối với các D-nucleotide ở vị trí cho. Nghiên cứu cũng xem xét khả năng enzyme xúc tác cho việc thêm nhóm phosphate thứ ba trong phản ứng ngược, và kết quả cho thấy enzyme có ái lực chọn lọc khác nhau giữa hai vị trí, với vị trí cho chỉ nhận D-nucleotides và vị trí tiếp nhận nhận UMP, CMP và các L-analogs như L-3TCMP và L-3TCDP.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Materials and methods
• Chemicals
• Cloning of the gene coding for UMP-CMP kinase, expression and purification of His-tagged UMP-CMP kinase
• Expression and purification of human UMP-CMP kinase as a fusion protein with GST
• Enzymatic activity of UMP-CMP kinase
• Results
• Analysis of the forward reaction catalysed by UMP-CMP kinase with natural substrates and nucleoside analogs
• The UMP-CMP kinase reverse reaction
• Discussion
• Acknowledgements
• References