Báo cáo khoa học: Increased amylosucrase activity and specificity, and identification of regions important for activity, specificity and stability through molecular evolution

Molecular Evolution To Improve Amylosucrase

Tác giả: Bart A. van der Veen, Lars K. Skov, Gabrielle Potocki-Véronèse, Michael Gajhede, Pierre Monsan, and Magali Remaud-Simeon

Lĩnh vực: Enzyme Engineering, Molecular Biology, Biochemistry

Nội dung tài liệu: Nghiên cứu này tập trung vào việc tối ưu hóa các đặc tính xúc tác của enzyme amylosucrase thông qua kỹ thuật tiến hóa định hướng. Mục tiêu là tạo ra các biến thể enzyme có hiệu quả cao hơn trong việc tổng hợp hoặc biến đổi polysaccharide. Phương pháp được áp dụng bao gồm đột biến ngẫu nhiên, tái tổ hợp gen và sàng lọc chọn lọc để xác định các biến thể cải tiến. Nghiên cứu đã xác định được các vùng quan trọng trong cấu trúc enzyme ảnh hưởng đến hoạt tính, đặc hiệu và độ bền nhiệt, từ đó cung cấp những hiểu biết mới cho việc kỹ thuật hóa enzyme amylosucrase cho các ứng dụng công nghiệp.

Mục lục chi tiết:

• Introduction
• Keywords
• Correspondence
• Abstract
• Amylosucrase: a glucansucrase from GH family 13
• Molecular evolution to improve amylosucrase
• Results and Discussion
• Library construction and screening for improved variants
• Kinetic analysis of the improved variants
• Polymerase efficiency of the improved variants
• Temperature dependency of (variant) amylosucrases
• Structural analysis of the mutations
• Regions involved in activity
• Regions involved in reaction specificity
• Regions involved in thermostability
• Mutations in the N-terminal domain
• Mutations in the C-terminal domain
• Experimental procedures
• Bacterial strains and plasmids/growth conditions
• DNA manipulations
• Generation of variant libraries
• Selection of positive clones
• Screening for improved amylosucrases
• Production and purification of improved variants
• Protein concentration determination
• Kinetic analysis of the improved variants
• Polymerase efficiency of the improved variants
• Temperature dependency of (variant) amylosucrases
• Acknowledgements
• References